DNA 塩基配列決定 (英語: DNA sequencing) とは、DNAを構成するヌクレオチドの結合順序（塩基配列）を決定することである。単にシークエンシングやシーケンシングとも呼ばれる。DNAは生物の遺伝情報を担う分子であり、基本的にはATCGの4種類の塩基からなる配列の形で符号化されている。そのため、DNAシークエンシングによりこの塩基の順序を調べることは、遺伝情報を解析する上で基本となる手段である。今日では配列決定はミクロなレベルの生物学の基盤となっているのみならず、分類学や生態学のようなマクロな生物学でも盛んに応用されている。また医学面でも遺伝病や感染症の診断や治療法の開発などに役立っている。 手法としては、1977年に開発されたやその改良法が長らく主流であったが、サンガー法とは異る原理に基づく手法も提唱されており、実用化されている。ウォルター・ギルバートとフレデリック・サンガーは、DNAシークエンシングの手法（サンガー法）を開発した功績により、1980年のノーベル化学賞を受賞している。
